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uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計測蘇丹紅含量

uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計測樣品中的蘇丹紅含量所需儀器與試劑

uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計(厚度為1cm的石英皿),上海奧析科學儀器有限公司

產品;R-250旋轉濃縮器,

2695液相色譜儀,美國Waters公司產品;

ZQ2000液質聯用儀,美國Waters公司產品;

FS-450超聲波萃取儀,上海奧析科學儀器有限公司;

HSG硅膠板,

蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號標準品,

蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號標準溶液100μg/mL.分別準確稱取25mg蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ標準品,用正己烷溶解并稀釋定容至250mL混勻.

展開劑:V(正己烷):V(乙酸乙酯)=100∶0.50.

正己烷、乙mi、乙醇、KOH、無水*,均為分析純.

乙腈、丙酮為色譜純.

所用水均為二次去離子水.1.2 操作步驟1.2.1 樣品處理

胡椒粉、紅辣椒粉、粉狀調味品、醬油、辣椒醬,均準確稱取1.00～5.00g,置于250mL錐形瓶中,加入100mL分析純正己烷,超聲振蕩20min,過濾,洗滌,定容.辣椒油、香腸、肉類及油類產品,均準確稱取5.00g,置于250mL錐形瓶中,加入30mL乙醇溶液,蕩動錐形瓶使樣品分散后,加入10.0mLKOH水溶液(質量分數為50%),回流皂化30min.分別用50mL乙mi提取三次,合并乙mi溶液,用質量分數為5%*水溶液洗滌3次.將乙mi液旋轉蒸發至近干后,用正己烷定容5mL.1.2.2 標準曲線的繪制分別準確吸取蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ標準液:0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00mL(分別含有0.0、5、10、50、100、150、200、300μg相應的蘇丹紅),用正己烷定容至10.0mL,混勻.在波長230nm處,用厚度為1cm石英比色皿,以空白溶液為參比在UV1901PC紫外可見分光光度計測定吸光度,以吸光度值A對濃度c作圖,繪制工作曲線.1.2.3 樣品分析硅膠板先用展開劑蒸氣飽和,再用微量進樣器將試樣溶液與蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ標準液同時點于同一薄層板上.*點:蘇丹紅Ⅲ3μL;第二點;蘇丹紅Ⅳ3μL;在蘇丹紅一側點樣液50μL(重復5個點).放入展開缸中,上行展開,室溫晾干,與標準比較定性.同時,刮取與標準品相同位置的樣品斑點和相同面積的空白硅膠,分別置于50mL燒杯中,加適量正己烷提取并定容至5.00mL.用uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計測定吸光度.根據吸光度值、取樣量、點樣量進行含量計算.

2 結果與討論

2.1 蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ的吸收光譜

按照操作步驟,將蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ5μg/mL標準溶液在uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計上繪制其吸收光譜,,蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ在紫外區230nm處,可見光區蘇丹紅Ⅲ在500nm處、蘇丹紅Ⅳ在510nm處存在吸收峰,顯然,230nm為zui大吸收波

長,故選擇230nm為檢測波長.

2.2 樣品處理

本實驗采用超聲萃取的方式提取目標物,并對脂類含量高的樣品皂化后再用乙mi提取.

2.3 干擾因素在測定蘇丹紅色素時,食品中天然紅色素的存在極大地干擾了檢測結果.食品中存在的天然紅色素主要是辣椒紅色素.辣椒紅色素是一類存在于成熟紅辣椒果實中的四萜類橙紅色色素.其中極性較大的紅色組分主要是辣椒紅素和辣椒玉紅素,占總量的50%～60%,另一類是極性較小的黃色組分,主要成分是β-胡蘿卜素和玉米黃質,它們具有VA活性.

辣椒紅素的外觀為深紅色粘性油狀液體,易溶于植物油、丙酮、乙mi、三lv甲wan,溶于乙醇,不溶于甘油和水,具有較好的分散性、耐熱性、耐酸性、耐堿性,但耐光性較差.辣椒紅色素組分的分子結構中所有的發色團(Chromophore)使其紫外-可見光區有著*的吸光區,因而其深液或結晶在可見光下具有十分絢麗的紅、橙或黃色.目前已知,辣椒紅素zui大的吸收峰的波長λmax約為460～475nm.在本實驗中,采用薄層分離的方法,使辣椒紅素與蘇丹紅分離,進而在蘇丹紅色素的紫外光區zui大吸收波長(230nm)處進行定量測定,避免了天然色素的干擾.2.4 展開劑的選擇蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ的結構相近,后者比前者多了兩個甲基,疏水性增強,利用這個性質,并參考了大量資料,實驗了幾十種不同的展開劑,其中展開效果較好的是:1)V(三lv甲烷wan)∶V(正己烷)=1∶1;2)V(sanlv甲wan)∶V(石油mi)∶V(醋酸)=75∶25∶0.5;3)V(正己烷)∶V(二lv甲wan)∶V(氨水)=6∶4∶0.18;4)V(正己烷)∶V(乙suan乙zhi)=100∶0.66.

2.4.實驗證明,展開劑4)能使樣液與標液同時分離出蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ,分離效果良好,是檢測蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ的良好展開劑.

2.5 回歸方程和線性范圍按上述工作曲線的繪制方法繪制標準曲線,得到蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ的回歸方程

2.6 精密度與檢出限

分別將質量濃度為5μg/mL蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ按實驗方法進行測定(n=10),得出其相對標準偏差分別為2.46%和1.57%.同時測定空白溶液(n=10)獲得檢出限蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ為0.05μg/mL.2.7 回收率與樣品分析取同一空白辣椒面樣品8份,加入不同量的蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ,按照操作步驟進行回收率試驗

3.得出,蘇丹紅Ⅲ在辣椒面中的回收率在90%～94%之間,蘇丹紅Ⅳ在辣椒面中的回收率在90%～96%之間

uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計測樣品中的蘇丹紅含量所需儀器與試劑

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產品;R-250旋轉濃縮器,

2695液相色譜儀,美國Waters公司產品;

ZQ2000液質聯用儀,美國Waters公司產品;

FS-450超聲波萃取儀,上海奧析科學儀器有限公司;

HSG硅膠板,

蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號標準品,

蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號標準溶液100μg/mL.分別準確稱取25mg蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ標準品,用正己烷溶解并稀釋定容至250mL混勻.

展開劑:V(正己烷):V(乙酸乙酯)=100∶0.50.

正己烷、乙mi、乙醇、KOH、無水*,均為分析純.

乙腈、丙酮為色譜純.

所用水均為二次去離子水.1.2 操作步驟1.2.1 樣品處理

胡椒粉、紅辣椒粉、粉狀調味品、醬油、辣椒醬,均準確稱取1.00～5.00g,置于250mL錐形瓶中,加入100mL分析純正己烷,超聲振蕩20min,過濾,洗滌,定容.辣椒油、香腸、肉類及油類產品,均準確稱取5.00g,置于250mL錐形瓶中,加入30mL乙醇溶液,蕩動錐形瓶使樣品分散后,加入10.0mLKOH水溶液(質量分數為50%),回流皂化30min.分別用50mL乙mi提取三次,合并乙mi溶液,用質量分數為5%*水溶液洗滌3次.將乙mi液旋轉蒸發至近干后,用正己烷定容5mL.1.2.2 標準曲線的繪制分別準確吸取蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ標準液:0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00mL(分別含有0.0、5、10、50、100、150、200、300μg相應的蘇丹紅),用正己烷定容至10.0mL,混勻.在波長230nm處,用厚度為1cm石英比色皿,以空白溶液為參比在UV1901PC紫外可見分光光度計測定吸光度,以吸光度值A對濃度c作圖,繪制工作曲線.1.2.3 樣品分析硅膠板先用展開劑蒸氣飽和,再用微量進樣器將試樣溶液與蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ標準液同時點于同一薄層板上.*點:蘇丹紅Ⅲ3μL;第二點;蘇丹紅Ⅳ3μL;在蘇丹紅一側點樣液50μL(重復5個點).放入展開缸中,上行展開,室溫晾干,與標準比較定性.同時,刮取與標準品相同位置的樣品斑點和相同面積的空白硅膠,分別置于50mL燒杯中,加適量正己烷提取并定容至5.00mL.用uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計測定吸光度.根據吸光度值、取樣量、點樣量進行含量計算.

2 結果與討論

2.1 蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ的吸收光譜

按照操作步驟,將蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ5μg/mL標準溶液在uv1901pc雙光束紫外可見分光光度計上繪制其吸收光譜,,蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ在紫外區230nm處,可見光區蘇丹紅Ⅲ在500nm處、蘇丹紅Ⅳ在510nm處存在吸收峰,顯然,230nm為zui大吸收波

長,故選擇230nm為檢測波長.

2.2 樣品處理

本實驗采用超聲萃取的方式提取目標物,并對脂類含量高的樣品皂化后再用乙mi提取.

2.3 干擾因素在測定蘇丹紅色素時,食品中天然紅色素的存在極大地干擾了檢測結果.食品中存在的天然紅色素主要是辣椒紅色素.辣椒紅色素是一類存在于成熟紅辣椒果實中的四萜類橙紅色色素.其中極性較大的紅色組分主要是辣椒紅素和辣椒玉紅素,占總量的50%～60%,另一類是極性較小的黃色組分,主要成分是β-胡蘿卜素和玉米黃質,它們具有VA活性.

辣椒紅素的外觀為深紅色粘性油狀液體,易溶于植物油、丙酮、乙mi、三lv甲wan,溶于乙醇,不溶于甘油和水,具有較好的分散性、耐熱性、耐酸性、耐堿性,但耐光性較差.辣椒紅色素組分的分子結構中所有的發色團(Chromophore)使其紫外-可見光區有著*的吸光區,因而其深液或結晶在可見光下具有十分絢麗的紅、橙或黃色.目前已知,辣椒紅素zui大的吸收峰的波長λmax約為460～475nm.在本實驗中,采用薄層分離的方法,使辣椒紅素與蘇丹紅分離,進而在蘇丹紅色素的紫外光區zui大吸收波長(230nm)處進行定量測定,避免了天然色素的干擾.2.4 展開劑的選擇蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ的結構相近,后者比前者多了兩個甲基,疏水性增強,利用這個性質,并參考了大量資料,實驗了幾十種不同的展開劑,其中展開效果較好的是:1)V(三lv甲烷wan)∶V(正己烷)=1∶1;2)V(sanlv甲wan)∶V(石油mi)∶V(醋酸)=75∶25∶0.5;3)V(正己烷)∶V(二lv甲wan)∶V(氨水)=6∶4∶0.18;4)V(正己烷)∶V(乙suan乙zhi)=100∶0.66.

2.4.實驗證明,展開劑4)能使樣液與標液同時分離出蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ,分離效果良好,是檢測蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ的良好展開劑.

2.5 回歸方程和線性范圍按上述工作曲線的繪制方法繪制標準曲線,得到蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ的回歸方程

2.6 精密度與檢出限

分別將質量濃度為5μg/mL蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ按實驗方法進行測定(n=10),得出其相對標準偏差分別為2.46%和1.57%.同時測定空白溶液(n=10)獲得檢出限蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ為0.05μg/mL.2.7 回收率與樣品分析取同一空白辣椒面樣品8份,加入不同量的蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ,按照操作步驟進行回收率試驗

3.得出,蘇丹紅Ⅲ在辣椒面中的回收率在90%～94%之間,蘇丹紅Ⅳ在辣椒面中的回收率在90%～96%之間