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葉綠素含量的測定

一、前言

葉綠素廣泛存在國術等綠色植物組織中，并在植物細胞中與蛋白質結合成葉綠體。當植物細胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩定，對光、熱比較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀釋堿液中可水解成鮮綠色的葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種；葉綠素a和b，兩者均易溶于乙醇、yimi、丙酮和lvfang。

葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：

1. 原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進而間接計算葉綠素的含量。
2. 分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯比爾定律計算出提取液中各色素的含量。
3. 葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm波長下的吸光值，并根據經驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量。

葉綠素與其他顯色物質一樣，在溶液中如液層厚度不變則其吸光度與它的濃度成一定的比例關系。已知葉綠素a、b在652nm波長處有相同的比吸收系數（均為34.5）。因此，在此波長下測定葉綠素溶液的吸光度，即可計算出葉綠素a、b的總量。

二、材料、儀器設備及試劑

1. 材料：水樣或植物中提取的葉綠素溶液
2. 儀器設備：電子分析天平；UV1800PC紫外可見分光光度計；漏斗：25ml容量瓶；剪刀；濾紙；玻棒等。
3. 試劑：95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉。

四、實驗步驟

1. 樣品的準備

2.測定

取1CM的比色皿，倒入樣品，以95%乙醇為空白對照，在UV1800PC紫外可見分光光度計625nm波長下讀取吸光度（A）值。

五．計算

將測得的吸光度652nm波長處的吸光度值輸入儀器公式，即可求得樣品中葉綠素濃度。所得結果再代入公式，即可得出樣品葉綠素的含量。

                A652

C（mg.ml-1)=    34.5

式中：C=葉綠素（a和b）的總濃度（mg.ml-1)

A652------  表示在652nm波長下測得樣品中葉綠素的吸光度

34.5為葉綠素a和b混合溶液在652nm波長的比吸收系數（比色皿光徑為1CM,樣品濃度為1g.L-1時的吸光度）。

葉綠素含量（mg.g-1Fw）=C（mg.ml-1)×提取液總量（mL）

                               樣品鮮重（g)

方法II

1. 目的

掌握葉綠素a、b含量測定的基本原理和方法。

2.原理

葉綠素a、b分別在663nm和645nm波長處有大的吸收峰，同時在該波長處葉綠素a、b的比吸收吸收K為已知，我們即可以根據朗博比爾定律，列出濃度C與吸光度A之間的關系式：

A663=82.04Ca+9.27Cb

A645=16.75Ca+45.6Cb

(1)、（2）式中的A663.A645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時測得的吸光度。

Ca、Cb為葉綠素a、b的濃度，單位為mg,L-1.

82.04、9,27為葉綠素a、b在波長663nm下的比吸收系數。

16.75、45.6為葉綠素a、b在波長645nm下的比吸收系數。

解（1）、（2）式聯立方程，得：

Ca=12.70   A663-2.69 A645

Cb=22.9 A645-4.68A663

CT-Ca+Cb=20.21A645+8.02A663

Ca、Cb為葉綠素a、b的濃度，CT為總葉綠素濃度，單位：（mg,L-1),利用上面（3,4,5）式可以分別計算出葉綠素a、b及總葉綠素濃度。

三、材料、儀器設備及試劑

1. 材料：菠菜葉、薺菜葉或其他植物葉片
2. 儀器設備：電子分析天平：分光光度計：恒溫水浴鍋：25ml刻度試管；剪刀；試管；試管架；玻棒等。
3. 試劑：80%乙醇

四實驗步驟

1. 葉綠素的提取
2. 從植株上選取有代表性的葉片數張（除去粗大葉脈）剪碎后混勻，快速稱取0.2g（可視樣品葉綠素含量高低而增減用量），置于25mL刻度試管中，加80%乙醇10ml左右，加塞放入60-80℃水浴中保溫提取葉綠素（或常溫下放在暗處浸提12~24h），至葉片全部褪綠為止，冷卻后，用80%乙醇定容至刻度，此液即為葉綠素提取液。
3. 測定
4. 取光徑為1CM的比色杯，加入葉綠素提取液距比色皿口1CM處，以80%乙醇作為對照，調到UV1800PC紫外可見分光光度計的多波長測量狀態，得出663nm及645nm波長下的吸光度值。

結果計算

將測定得到的吸光度A663、A645值分別代入式中計算出Ca、Cb及CT（即葉綠素a、b及葉綠素總量濃度）。再按下式計算出葉綠素a、b及葉綠素總含量。

葉綠素a含量（mg.g-1Fw)=      Ca×提取液總量（ml)  

                             樣品鮮重（g）×1000 

葉綠素b含量（mg,g-1 Fw)=     Cb×提取液總量（ml) 

                                樣品鮮重（g)×1000

葉綠素總含量（mg.g-1Fw)=     CT×提取液總量（ml) 

                                樣品鮮重（g)×1000

后計算出葉綠素a/葉綠素b的比值，并加以分析。

原理

根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公司計算出提取液中各色素的含量。根據朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即A=acl   式中a比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1CM時，a為該物質的吸光系數。各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在響應波長下吸光度的綜合。這就是吸光度的加和性。此次試驗測定葉綠素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b 時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的大吸收峰。

二．材料、儀器設備及試劑

• 材料：新鮮（或烘干）的植物葉片。
• 儀器設備：1.UV1800PC紫外可見分光光度計；2。電子頂載天平（感量0.01g);3.研缽；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量濾紙；7.吸水紙；擦境紙；9滴管。
• 試劑：96%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉。

三．實驗步驟

1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈）混勻。2.稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2~3mL 95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續研磨至組織變白。靜置3`5min.3.取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，后連同殘渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。后用乙醇定容至25mL，搖勻。5.把葉綠體色素提取液倒入光徑1CM的比色皿內，以95%乙醇為空白，在UV1800PC紫外可見分光光度計單機模式，多波長測量中得出 波長665nm、649nm下的吸光度值。

實驗結果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式中：

Ca=13.9665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665.據此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb;mg/L），二者之和為總葉綠素的濃度。后根據下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量；

葉綠素的含量（mg/g)=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數】/樣品鮮重（或干重）。